1989年，F(xiàn)ields**報告酵母雙雜交(Y2H)分析，這種方法利用轉(zhuǎn)錄因子與成對的蛋白質(zhì)兩部分相結(jié)合來檢測這些成對蛋白之間的相互作用關(guān)系。假如這兩種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，轉(zhuǎn)錄因子就可重建，從而激活報告基因，促使酵母生長。
目前法國的Hybrigenics公司和瑞士的Dualsystems Biotech公司均提供Y2H篩選服務(wù)。
“酵母雙雜交有著巨大的優(yōu)勢，但也有一個不利之處：它可以檢測低親和力，”德國Max Delbrück分子醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)蛋白組學(xué)研究人員Erich Wanker說。換句話說，這種分析可以鑒別出微弱的短暫的配對蛋白例如那些延伸細胞信號的蛋白，但也可以檢測隨機撞在一起的蛋白質(zhì)。“到底我們要真正相信在哪個點發(fā)生了相互作用?”Wanker問道。
現(xiàn)在科學(xué)家們已經(jīng)找到多種檢測和避免各種假陽性結(jié)果的方法?！罢承浴钡鞍追翘禺愋越Y(jié)合到其他蛋白質(zhì)上的假象可以被鑒別和排除。通過單個導(dǎo)入蛋白而非重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子促進的酵母生長，現(xiàn)在也可以被識別。
**的系統(tǒng)確保了所有期望的組合均能得到測試。現(xiàn)在不再采用所有的基因轉(zhuǎn)染相同的酵母細胞的方法篩查兩種潛在的互作伴侶，而是將轉(zhuǎn)染單個基因的酵母雜交，檢測其后代的生長。機器人系統(tǒng)將酵母精細混合，每次分析可運行多個重復(fù)。觀察到相同互作的次數(shù)成為了質(zhì)量評估的一部分?！拔覀冋J為Y2H可以生成可靠且可重復(fù)的結(jié)果，”Wanker說。
盡管如此，也還是有一些互作不會在Y2H中觀察到。例如，Y2H要求互作蛋白必須要使轉(zhuǎn)錄因子的兩部分重新結(jié)合，蛋白質(zhì)必須要能夠進入細胞核激活報告基因。因此，膜特異性蛋白或細胞器特異性蛋白的互作就無法看到。
除了Y2H，哺乳動物細胞中低通量的檢測也可用于篩查相互作用：這些測試包括LUMIER(luminescence-based mammalian interactome)系統(tǒng)、哺乳動物細胞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系統(tǒng)、蛋白芯片和蛋白片段互補測定法(protein fragment complementation assay：PCA)。盡管它們的數(shù)量級低于Y2H，它們也可以探測更多相關(guān)背景下的互作。
哺乳動物細胞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系統(tǒng)是高通量的哺乳動物篩選系統(tǒng)之一。該系統(tǒng)利用的并非是酵母轉(zhuǎn)錄因子，而是一種哺乳動物細胞因子受體。這種細胞因子受體同樣被分割，當(dāng)重建時才能夠傳導(dǎo)信號。2009年，比利時法蘭德斯跨學(xué)院生物技術(shù)研究所(VIB)的網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)家Jan Tavernier描述了更高通量的MAPPIT系統(tǒng)，在這一系統(tǒng)中可編碼與細胞因子受體片段連接的潛在互作伴侶蛋白的質(zhì)粒被分別置于小孔中保存。實驗之初，將可表達可與選擇性“誘餌”連接的細胞因子受體片段的細胞加入到小孔中。當(dāng)互作發(fā)生時，信號就會激活發(fā)光熒光素酶。
利用多孔板，花費約2,000(2600美金)就可以篩選一個針對人類ORFeome(一整套克隆蛋白編碼開放閱讀框)的誘餌蛋白。 Tavernier表示希望能夠在今年晚些時候?qū)崿F(xiàn)在微芯片上運行MAPPIT。微型化檢測可將成本降低到100，并在1星期內(nèi)檢測針對100個誘餌的 ORFeome。
Tavernier說以這樣的高通量和成本，各種新實驗將變得可行，而不再將篩查局限于酵母細胞?！澳汩_始在適當(dāng)?shù)奈锓N中繪制完整的互作組，”Tavernier說。此外，Tavernier還計劃用**或有毒化合物來處理的細胞比較互作組的變化。他希望能將這一技術(shù)商業(yè)化，并正與 Vidal及其他科學(xué)家們一起致力利用MAPPIT 和 Y2H檢測繪制人類蛋白質(zhì)互作。
LUMIER也是相對高通量的系統(tǒng)，可用于檢測是否存在受**、**或其他添加物影響的特異互作。在這些檢測中，兩種蛋白被用于瞬時轉(zhuǎn)染細胞。一種蛋白連接上稱之為FLAG的親水性肽。潛在的互作伴侶蛋白連接上熒光素酶。細胞裂解，F(xiàn)LAG標(biāo)記的蛋白被捕獲，利用它們發(fā)出的熒光來檢測互作伴侶蛋白的存在。
蛋白片段互補測定(PCA)既可以在酵母細胞也可以在哺乳動物細胞中進行，主要取決于重構(gòu)的大量“報告子”，通常是酶或熒光蛋白。因為報告子能夠在整個細胞發(fā)送信號，在它們自然發(fā)生的地方就可以檢測到互作。
在2009年發(fā)布的論文中，Vidal, Wanker和其他研究人員描述了Vidal在高通量篩選中評估發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)互作的實證框架。事實上，這意味著重復(fù)實驗采用了不同類型的檢測，并與對照組結(jié)果進行了比較。陽性對照是從文獻中仔細挑選出的大約100種已確立的互作。陰性對照是100個隨機指定的配對蛋白，它們過去從未發(fā)現(xiàn)能相互結(jié)合。對檢測條件進行調(diào)整以提高對陽性對照的檢測，而避**測隨機互作。
作為《自然方法》(Nature Methods)雜志上提出的框架的一部分，來自互作研究的結(jié)果應(yīng)該在不同類型的檢測中進行確證。越多的方法發(fā)現(xiàn)相同的互作，研究人員就越能確信得到的結(jié)果。不過總體上，這些方法也只能檢測大約70%的陽性參考設(shè)置。
高通量實驗并不是**鑒別蛋白質(zhì)間互作的途徑。還有幾種數(shù)據(jù)庫，例如生物學(xué)相互作用通用庫(Biological General Repository for Interaction Datasets, BioGRID)和IntAct都搜集了文獻上發(fā)布的，從小型和高通量實驗，以及其他分析推斷的預(yù)測互作中挑選出的互作列表。
歐洲生物信息研究所EBI(European Bioinformatics Institute)蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)協(xié)調(diào)員Sandra Orchard幫助開發(fā)了小的信息標(biāo)準(zhǔn)輔助分享和評估互作數(shù)據(jù)。她認為這一列表甚至遠未接近完成，她估計對于人類互作組，這個數(shù)字會小于百分之十，其中甚至包括已發(fā)表但還未被數(shù)據(jù)庫收錄的數(shù)據(jù)。她說?！叭绻苡^察到十分之三的酵母互作組，我們就是非常幸運了。”
原文摘要：
Proteomics: The interaction map
As increasing numbers of protein–protein interactions are identified, researchers are finding ways to interrogate these data and understand the interactions in a relevant context.
Around the time that scientists celebrated the completion of the draft sequence of the human genome, papers from two separate groups described results of another project that tested all the possible pairings of thousands of yeast proteins to see whether they interact.
The importance of protein–protein interactions is beyond dispute. Little happens in a cell without one protein 'touching' another. Whether a cell divides, secretes a hormone or triggers its own death, protein–protein interactions make the event happen. Consequently, comprehensive maps showing which proteins came together in a yeast cell were much anticipated.
