來(lái)自上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的研究人員發(fā)表了題為“A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins”的文章，應(yīng)用氧化還原敏感的Gaussia熒光素酶和綠色熒光蛋白GFP，報(bào)告融合蛋白所處的不同氧化還原環(huán)境，從而鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的亞定位及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。相關(guān)成果公布在PLoS ONE雜志上。
領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是上海生科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所胡紅雨研究員，其研究組主要研究方向是蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、淀粉樣積聚和降解作用的分子機(jī)制及與神經(jīng)退行性**的關(guān)系。**作者是博士生李海音，這項(xiàng)研究得到了國(guó)家科技部、科學(xué)院和國(guó)家基金委的經(jīng)費(fèi)支持。
真核細(xì)胞中約有三分之一的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊、修飾、膜整合、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)和跨膜蛋白在這些過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。但是，由于跨膜蛋白疏水區(qū)域與膜脂結(jié)合的復(fù)雜性，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)性，現(xiàn)有的鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方法非常有限，且存在操作技術(shù)繁瑣等問(wèn)題。
Gaussia熒光素酶(Gluc)是近年報(bào)道的分子量小、活性很高的熒光素酶，含有五對(duì)二硫鍵，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境中才具有完全的發(fā)光活性。
在這篇文章中，研究人員利用Gluc的發(fā)光活性對(duì)氧化還原敏感的特性，將Gluc與GFP串聯(lián)表達(dá)作為新的報(bào)告基因，融合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的不同位點(diǎn)，并在HEK 293T細(xì)胞中表達(dá)。他們以Gluc的發(fā)光活性檢測(cè)融合位點(diǎn)的氧化還原環(huán)境，而用GFP的熒光強(qiáng)度檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)量，從而報(bào)告不同融合位點(diǎn)的相對(duì)氧化還原環(huán)境。
該方法可用于區(qū)分其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細(xì)胞質(zhì)，以此鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，已成功應(yīng)用于單次跨膜蛋白(如 calnexin、Sec61g 和CD3δ)和多次跨膜蛋白(如Herp和HRD1)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該方法靈敏度高、簡(jiǎn)單快速，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的高通量鑒定成為可能。
也可進(jìn)一步應(yīng)用于鑒定細(xì)胞膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以及檢測(cè)蛋白質(zhì)分泌途徑中的氧化還原環(huán)境變化，將為研究蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位、折疊、氧化還原和修飾，以及動(dòng)態(tài)的膜整合、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌提供更加適用、方便和高效的生化和細(xì)胞分析技術(shù)。
作者簡(jiǎn)介：
胡紅雨
研究員，研究組長(zhǎng)，博士生導(dǎo)師
個(gè)人簡(jiǎn)介：
1987年畢業(yè)于復(fù)旦大學(xué)生物系，1990年復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系碩士學(xué)位，1993年獲中科院上海生化所博士學(xué)位。1993-1994年任中科院上海生化所助研，1994-1996年在香港科技大學(xué)生化系做博士后研究。1996-2000年任中科院上海生化所副研究員，2000年6-12月在美國(guó)康涅狄格大學(xué)醫(yī)學(xué)中心NMR結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室做訪問(wèn)學(xué)者。2001年起任中科院上海生化與細(xì)胞所研究員。2002年10月-2003年4月香港科技大學(xué)生化系訪問(wèn)學(xué)者。2004年9月-12月美國(guó) Scripps研究所分子與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)系訪問(wèn)學(xué)者。2005年起，國(guó)際刊物Protein & peptide Letters和Acta Biochem. Biophys. Sinica編委(Editorial Board Member)。
研究方向：蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和降解作用
研究工作：
蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、淀粉樣積聚和降解作用的分子機(jī)制及與神經(jīng)退行性**的關(guān)系。神經(jīng)退行性**(如帕金森癥)的發(fā)生與神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊、異常積聚和包涵體形成有關(guān)。本課題組著重研究神經(jīng)退行性**相關(guān)的蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊、淀粉樣積聚和生物降解作用的分子機(jī)制。在結(jié)構(gòu)信息基礎(chǔ)上，結(jié)合生物化學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果理解蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、淀粉樣化積聚和生物降解的效應(yīng)及與神經(jīng)退行性**發(fā)生的聯(lián)系。用核磁共振和其它結(jié)構(gòu)分析法解析蛋白質(zhì)異常積聚和生物降解過(guò)程中的蛋白質(zhì)或特定結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)和這些蛋白質(zhì)間的相互作用以及生物功能。感興趣的三個(gè)方向：(1) 與帕金森癥相關(guān)的alpha-突觸核蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、淀粉樣積聚和分子識(shí)別的機(jī)制，抑制alpha-突觸核蛋白異常積聚的化合物及抑制作用機(jī)理;(2) 泛素-蛋白酶體降解途徑中蛋白質(zhì)相互作用的NMR結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及生物功能;(3) 神經(jīng)退行性**相關(guān)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制。
原文摘要：
A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins
Correct localization and transmembrane topology are crucial for the proteins residing and functioning in the endoplasmic reticulum (ER). We have developed a rapid and convenient assay, based on the redox-sensitive luciferase from Gaussia princeps (Gluc) and green fluorescence protein (GFP), to determine the localization or topology of ER proteins. Using the tandem Gluc-GFP reporter fused to different positions of a target protein, we successfully characterized the topologies of two ER transmembrane proteins Herp and HRD1 that are involved in the ER quality control system. This assay method may also be applicable to the proteins in secretory pathway, plasma membrane, and other compartments of cells.
