說到轉(zhuǎn)染，怎么能忘了Invitrogen，也就是現(xiàn)在的Life Technologies呢?自1993年Lipofectamine? 試劑上市以來，它一直是市場(chǎng)上賣得火的轉(zhuǎn)染試劑。直到后來Lipofectamine 2000、RNAiMAX、LTX上市，Lipo旋風(fēng)越刮越猛。至于小分子RNA的轉(zhuǎn)染，有Lipofectamine 2000和RNAiMAX兩員猛將頂著，似乎可以高枕無憂，但I(xiàn)nvitrogen還在開發(fā)更多的轉(zhuǎn)染試劑和儀器，試圖覆蓋更廣的市場(chǎng)。
有些百毒不侵的細(xì)胞，你還真拿它沒辦法，轉(zhuǎn)染試劑就是不管用。這時(shí)，我們得換一招。你有兩個(gè)選擇：電穿孔和病毒。體驗(yàn)過的人都知道，用病毒作為載體來轉(zhuǎn)染相當(dāng)復(fù)雜。通常需要構(gòu)建重組子，讓它表達(dá)前體miRNA或shRNA，然后收集病毒粒子，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，在那里生成有功能的sirna或miRNA模擬物。如果順利的話，大概需要幾個(gè)星期。
電穿孔這種方法就相對(duì)簡(jiǎn)單一些，但你需要投入一臺(tái)儀器。過去的說法是，這種方法毒性較大，誘導(dǎo)細(xì)胞膜上形成孔的電脈沖會(huì)殺死一定比例的細(xì)胞，因此，每次實(shí)驗(yàn)都需要一定量的細(xì)胞。
為了克服這些問題，invitrogen 2009年推出了Neon系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的電穿孔儀器相比，它的獨(dú)特之處在于用一個(gè)特別的移液器吸頭取代了傳統(tǒng)的電擊杯。這樣流程就簡(jiǎn)化了：只需將細(xì)胞和核酸吸入Neon? 移液器吸頭中，再插入到移液器吸頭架上，即可開始。據(jù)Invitrogen介紹，由于電極的獨(dú)特設(shè)計(jì)，表面積比標(biāo)準(zhǔn)電擊杯要小，因此電穿孔更為溫和，細(xì)胞存活率也更高。
目前，Neon已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染了多個(gè)細(xì)胞系，包括原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、原代樹突狀細(xì)胞、Jurkat、小鼠胚胎干細(xì)胞等，在多數(shù)細(xì)胞類型中獲得超過75%的轉(zhuǎn)染效率。如果你們實(shí)驗(yàn)室的研究對(duì)象是干細(xì)胞或原代細(xì)胞，這確實(shí)是個(gè)不錯(cuò)的選擇，就是價(jià)格不那么可愛，在12萬左右。
前面說了這么多，都是轉(zhuǎn)染細(xì)胞的，至于活體轉(zhuǎn)染，雖不能說是處女地，也仍是各公司較少涉獵的領(lǐng)域。然而，很多動(dòng)物模型的研究人員又急切盼望開發(fā)出活體轉(zhuǎn)染的試劑。在N年前，就有人拿Lipofectamine 2000進(jìn)行活體轉(zhuǎn)染，效果似乎也還行。這么多年過去，Invitrogen終于順應(yīng)民心開發(fā)出了Invivofectamine?，F(xiàn)在又升級(jí)為2.0版。
Invivofectamine 2.0試劑是一種專為siRNA導(dǎo)入而設(shè)計(jì)的活體RNAi轉(zhuǎn)染試劑，無毒性和**刺激性，能夠讓研究人員在小的動(dòng)物模型上開展高效的小RNA干擾實(shí)驗(yàn)。通過尾部靜脈注射，Invivofectamine 2.0可將合成的siRNA帶到肝臟，產(chǎn)生高水平的mRNA沉默。實(shí)驗(yàn)證明，Invivofectamine 2.0和附帶的陽性對(duì)照Ambion In Vivo siRNA注入后，定向的基因沉默可持續(xù)三周以上。
實(shí)驗(yàn)過程也并不復(fù)雜(如下圖)。只需將500 μl Invivofectamine 2.0和500 μl siRNA(1.5 mg/ml)混合后，在50℃孵育30分鐘，再透析至生理?xiàng)l件，即可注射。
大家肯定很關(guān)心干擾的持續(xù)時(shí)間。研究表明，Invivofectamine 2.0-siRNA復(fù)合物的knockdown時(shí)間是取決于劑量的，同時(shí)也受siRNA分子穩(wěn)定性的影響。研究人員曾注射了 Invivofectamine 2.0試劑及兩條序列相同的siRNA，一條是有著Ambion In Vivo siRNA修飾，另一條則沒有修飾。
至于注射后siRNA的分布，Invitrogen也做過研究。正如預(yù)期，大部分siRNA在靜脈注射后進(jìn)入肝臟細(xì)胞，還有一些進(jìn)入脾臟和腎臟。在腎臟中，冰凍切片顯示標(biāo)記的siRNA進(jìn)入腎小球。有趣的是，如果是腹腔注射，那情況則有所變化。標(biāo)記的 siRNA會(huì)進(jìn)入脾臟和胰腺細(xì)胞，以及肝臟，但數(shù)量會(huì)低于靜脈注射。
Invivofectamine 2.0目前有兩種規(guī)格：1 mL和5×1 mL，價(jià)格分別為14092和51917元。雖說大包裝便宜些，不過有一點(diǎn)需要特別提醒，Invivofectamine 2.0的保質(zhì)期只有6個(gè)月，算上訂貨那一個(gè)來月的時(shí)間，到手后估計(jì)只剩4個(gè)月，如果沒把握在這段時(shí)間用完的話，還是不要買那么多了。
