鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)新方法

4月18日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《公共科學(xué)圖書(shū)館—綜合》(PLoS ONE)在線發(fā)表了中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細(xì)胞所胡紅雨課題組的研究論文“A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins”。該論文應(yīng)用氧化還原敏感的Gaussia熒光素酶和綠色熒光蛋白GFP，報(bào)告融合蛋白所處的不同氧化還原環(huán)境，從而鑒定目標(biāo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的亞定位及其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

真核細(xì)胞中約有三分之一的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行折疊、修飾、膜整合、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)和跨膜蛋白在這些過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能。但是，由于跨膜蛋白疏水區(qū)域與膜脂結(jié)合的復(fù)雜性，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)性，現(xiàn)有的鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方法非常有限，且存在操作技術(shù)繁瑣等問(wèn)題。

Gaussia熒光素酶(Gluc)是近年報(bào)道的分子量小、活性很高的熒光素酶，含有五對(duì)二硫鍵，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境中才具有完全的發(fā)光活性。博士生李海音等利用Gluc的發(fā)光活性對(duì)氧化還原敏感的特性，將Gluc與GFP串聯(lián)表達(dá)作為新的報(bào)告基因，融合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的不同位點(diǎn)，并在HEK 293T細(xì)胞中表達(dá)。他們以Gluc的發(fā)光活性檢測(cè)融合位點(diǎn)的氧化還原環(huán)境，而用GFP的熒光強(qiáng)度檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)量，從而報(bào)告不同融合位點(diǎn)的相對(duì)氧化還原環(huán)境。

該方法可用于區(qū)分其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細(xì)胞質(zhì)，以此鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，已成功應(yīng)用于單次跨膜蛋白(如calnexin、Sec61g 和CD3δ)和多次跨膜蛋白(如Herp和HRD1)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該方法靈敏度高、簡(jiǎn)單快速，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的高通量鑒定成為可能。同時(shí)，也可進(jìn)一步應(yīng)用于鑒定細(xì)胞膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以及檢測(cè)蛋白質(zhì)分泌途徑中的氧化還原環(huán)境變化，將為研究蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位、折疊、氧化還原和修飾，以及動(dòng)態(tài)的膜整合、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌提供更加適用、方便和高效的生化和細(xì)胞分析技術(shù)。